（一）模型評(píng)價(jià)方法：

1. 臨床癥狀觀察：

血清中肝功生化指標(biāo)的兩種轉(zhuǎn)氨酶（ALT，AST）是肝損傷的重要標(biāo)志物，GGT的變化除了能表明肝炎急性期和慢性期的情況，同時(shí)對(duì)于肝臟腫瘤也具有一定的指示作用。這些指標(biāo)可通過(guò)常規(guī)血清檢測(cè)得到數(shù)據(jù)。

2. 病毒載量測(cè)定方法：

（1）WHV病毒DNA的提?。?/p>

血清樣本處理：用促凝采血管收集的血樣，室溫放置30min后，3000rpm室溫離心10min，得到上層血清放入離心管中備用；組織樣本處理：檢測(cè)WHV病毒載量主要組織樣本為肝臟，分別在每個(gè)肝葉取約50mg樣本，用生理鹽水漂洗后，加入到含蛋白酶K的DNA裂解液中，裂解16h至組織破碎完全。使用DNA提取試劑盒提取病毒DNA，最后用30μl水溶解DNA。短期保存可存放于4℃冰箱，若需長(zhǎng)期保存需存放于-20℃冰箱。

（2）WHV病毒載量的測(cè)定：實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：DNA樣品制備：待測(cè)樣本：待檢測(cè)的感染W(wǎng)HV病毒的土撥鼠血清，按照5.2.1所用方法提取WHV病毒DNA；標(biāo)準(zhǔn)品：已知濃度的WHV-DNA質(zhì)粒，按照109、108、107、106、105、104、103copies/μl進(jìn)行稀釋?zhuān)豢瞻讓?duì)照：分子級(jí)無(wú)菌蒸餾水 (無(wú)RNA酶和DNA酶)；陰性對(duì)照：未感染W(wǎng)HV病毒的土撥鼠血清；

實(shí)驗(yàn)步驟：（a）每個(gè)待檢測(cè)樣本反應(yīng)液的組成為：

2×SYBRAdvantage qPCR Premix 10 ul primer-forward（20μM）1 ul primer-reverse（40μM）1 ul TemplateDNA 2 ul Total 20 ul

WHVprimer: Forward primer 5'-TCTCCTGGACTGGAAAGGTT-3'

Reverseprimer5'-ATTGAGCCAAGAGAAACGGG-3'

（b）擴(kuò)增條件設(shè)定：

（3）儀器檢測(cè)通道選擇：

使用ABIStepOne Plus熒光PCR檢測(cè)儀時(shí)選擇SYBR Green熒光信號(hào)，收集設(shè)在58℃。具體設(shè)置方法請(qǐng)參照各儀器使用說(shuō)明書(shū)。

（4）結(jié)果分析閾值設(shè)定：

使用ABIStepOne Plus熒光PCR檢測(cè)儀進(jìn)行結(jié)果分析，基線和閾值設(shè)定根據(jù)儀器噪音情況調(diào)整。

（5） 熒光定量PCR反應(yīng)系統(tǒng)的質(zhì)量控制：

a. 反應(yīng)結(jié)果應(yīng)同時(shí)符合以下條件，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。

陰性對(duì)照：無(wú)擴(kuò)增，為陰性。

標(biāo)準(zhǔn)品：CT值＜28

否則結(jié)果無(wú)效。

b. 結(jié)果判斷：

陰性：無(wú)CT值或CT值大于38

陽(yáng)性：CT值＜38，可報(bào)告為陽(yáng)性。

CT值大于38的樣本建議重做，若重做結(jié)果CT值＜38，該樣本判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。

陽(yáng)性樣本具體載量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

圖5. 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線

3. 病理分析：HE染色

組織樣本經(jīng)固定、包埋、切片處理后，可通過(guò)H&E染色觀察感染動(dòng)物組織內(nèi)的損傷情況和炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)狀況。具體步驟如下：

用10%福爾馬林固定72h，在24h內(nèi)可換液一次；將固定的組織修塊后脫水、透蠟用石蠟包埋；隨后石蠟塊進(jìn)行切片；石蠟切片脫蠟后，進(jìn)行蘇木精染色；切片繼續(xù)脫水后染伊紅；最后進(jìn)行透明、封片，得到HE病理切片，可進(jìn)行鏡檢。標(biāo)本切片可長(zhǎng)期保存。

（二）評(píng)價(jià)指標(biāo)：

1. 臨床癥狀評(píng)價(jià)：

由于免疫系統(tǒng)未發(fā)育完全，新生土撥鼠感染W(wǎng)HV病毒后，有60%-70%的概率發(fā)展成慢性感染。在感染急性期，肝功生化指標(biāo)（ALT和AST）都有升高，表現(xiàn)出肝臟損傷；而長(zhǎng)期的病毒復(fù)制導(dǎo)致慢性肝炎，期間雖然血液中檢測(cè)的病毒載量會(huì)有波動(dòng)，但肝部損傷加劇，且肝臟炎癥和腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)升高。

2. 病毒復(fù)制情況評(píng)價(jià)體系：

在急性感染期，WHV病毒在血液中的水平在感染后5-6個(gè)月達(dá)到峰值，平均載量約為107copies/ml。此后由于機(jī)體無(wú)法清除病毒，WHV在肝臟中長(zhǎng)期復(fù)制，在血液中能持續(xù)檢測(cè)到病毒核酸，病毒在血液中的水平大部分時(shí)間維持在104copies/ml。

3. 病理評(píng)價(jià)體系：

WHV病毒感染土撥鼠，在慢性期肝臟病理發(fā)生顯著變化，可觀察到慢性炎癥表型，包括：肝竇擴(kuò)張，大量炎細(xì)胞彌漫浸潤(rùn)等。

WHV病毒具有種屬特異性，只感染土撥鼠，不感染人和其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；且未出現(xiàn)在《人間傳染的病原微生物名錄》中。動(dòng)物感染病毒和飼養(yǎng)都可在普通環(huán)境中進(jìn)行，但需跟土撥鼠繁殖區(qū)分開(kāi)。WHV病毒已經(jīng)過(guò)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，具有相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序。模型實(shí)驗(yàn)已得到IACUC批準(zhǔn)，獲得實(shí)驗(yàn)資質(zhì)。

WHV病毒只對(duì)土撥鼠敏感，并不感染人、以及小鼠大鼠等常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；在土撥鼠種群中常為垂直感染模式，實(shí)驗(yàn)室中采用的為血液感染模式。為預(yù)防對(duì)其他土撥鼠的影響，實(shí)驗(yàn)人員均需經(jīng)過(guò)生物安全培訓(xùn)獲得證書(shū)，具有生物安全操作資質(zhì)；進(jìn)入動(dòng)物房之前，穿戴防護(hù)服、口罩、帽子、鞋套等進(jìn)行防護(hù)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后按要求去除防護(hù)設(shè)備集中處理。盡量避免進(jìn)入感染動(dòng)物區(qū)后再進(jìn)入繁殖區(qū)，若需進(jìn)入則應(yīng)更換整套個(gè)人防護(hù)設(shè)備。

由于感染W(wǎng)HV土撥鼠血液中可能存在著大量病毒，因此對(duì)于采血后的耗材、以及沾染到血液的墊料等，都需要進(jìn)行高壓滅菌處理，以消除正常土撥鼠的潛在感染源。動(dòng)物感染病毒后取得的血液和組織直接放入核酸裂解液或組織固定液，滅活病毒。所有涉及到的相關(guān)污染物如離心管、灌胃針、手術(shù)剪、手術(shù)鑷和毒株等將統(tǒng)一高溫高壓消毒后集中處理。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均在ABSL-2動(dòng)物房的生物安全柜中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)后將病毒毒株、動(dòng)物尸體、尿墊等包裝好進(jìn)行高壓滅菌處理，注射器放入利器桶處理。

1. 急性期肝炎

土撥鼠感染W(wǎng)HV后第8周，血清中病毒載量達(dá)到最高峰（106拷貝/ml，圖1），血清中WHsAg濃度與病毒載量相對(duì)應(yīng)，在感染后8周達(dá)到最高值（圖2A），感染后血清中WHcAb自第2周開(kāi)始檢出，且濃度不斷升高，低劑量組的WHcAb濃度在第8周達(dá)到最高峰，而高劑量組則持續(xù)增高（圖2B）。在此期間，土撥鼠的肝功酶活性維持在較高水平：ALT和AST分別達(dá)到正常值的4～8倍和3～4倍（圖3）。自感染后至16周，病毒復(fù)制、血清學(xué)指標(biāo)和肝功能均處于較高水平，表明WHV感染的土撥鼠在此階段處于急性肝炎期。急性肝炎期的病理表現(xiàn)為：匯管區(qū)肝細(xì)胞出現(xiàn)點(diǎn)灶狀肝細(xì)胞壞死伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)及散在出血（圖4A、4B），免疫組化染色顯示肝細(xì)胞胞漿出現(xiàn)大量的WHsAg染色顆粒 (圖4C、4D)。

圖1土撥鼠血清中病毒載量（lg 拷貝/ml）

2. 土撥鼠肝炎病毒感染后急性期向慢性期的轉(zhuǎn)變

感染后16周至24周，低劑量組土撥鼠血清中病毒DNA逐漸降低并消失（圖1），與此相對(duì)應(yīng)，其血清中WHsAg也漸趨于消失（圖2A），而WHcAb則維持在較低水平（圖2B）。同時(shí)，低劑量組土撥鼠的肝功酶ALT和AST也逐漸降低到感染前水平（圖3），這些結(jié)果表明：低劑量組感染土撥鼠已由急性感染轉(zhuǎn)為自愈。與低劑量組相反，高劑量組土撥鼠血清中病毒載量一直處于較高水平，截止到檢測(cè)之日（第24周），病毒DNA拷貝數(shù)一直維持在105拷貝/ml左右（圖1）。與急性期相比，血清中WHsAg濃度略有下降（圖2A），但WHcAb濃度則不斷增高（圖2B），同時(shí)，肝功酶ALT和AST的水平呈下降趨勢(shì)，但仍為正常值的1倍左右（圖3）。該結(jié)果表明：高劑量組土撥鼠仍維持低水平感染，提示向慢性肝炎的轉(zhuǎn)變。

圖2A 土撥鼠血清中表面抗原檢測(cè) (OD450)

圖2B土撥鼠血清中核心抗體檢測(cè)結(jié)果(OD450)

圖3A 土撥鼠血清肝功酶AST檢測(cè)結(jié)果（U/L）

圖3B 土撥鼠血清肝功酶ALT檢測(cè)結(jié)果（U/L）

圖4 低劑量組16周肝臟病理變化。注：A、C為對(duì)照組肝臟HE染色和免疫組化WHsAg染色結(jié)果。B 為低劑量組感染后第16周肝臟組織HE染色，D為WHsAg免疫組化染色

1. 病毒制備

WHV為cWHV7P1毒株（NCBI存儲(chǔ)號(hào):M18752.1），來(lái)自美國(guó)喬治敦大學(xué)微生物與免疫室，采集來(lái)自慢性感染土撥鼠的血清，病毒儲(chǔ)存液濃度為1×1010 拷貝/ml。

2. 動(dòng)物

7日齡-1月齡土撥鼠。實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行血清病毒W(wǎng)HV DNA 的PCR檢查，陰性土撥鼠方可入組。

3. 感染實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物經(jīng)獸用氯胺酮麻醉后，經(jīng)頸外靜脈注射WHV，感染劑量分別為5×106 WID50（低劑量）和1×107 WID50（高劑量），感染體積為100 μl，病毒儲(chǔ)存液用生理鹽水稀釋?zhuān)瑢?duì)照組土撥鼠注射等體積的生理鹽水，感染后的土撥鼠隔離飼養(yǎng)。在感染后不同時(shí)間點(diǎn)，動(dòng)物經(jīng)獸用氯胺酮麻醉后，心臟取血，離心分離血清。

4. 血清檢測(cè)

感染后血清標(biāo)志物檢測(cè)：土撥鼠肝炎病毒表面抗原（WHsAg）和核心抗原（WHcAg）經(jīng)過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，經(jīng)鎳離子親和層析純化。WHsAg分別免疫兔和雞后獲得兔抗WHsAg抗體和雞抗WHsAg抗體。通過(guò)ELISA雙抗夾心法檢測(cè)WHsAg，ELISA直接法檢測(cè)WHcAb。

5. 核酸檢測(cè)

使用DNA提取試劑盒QIAamp MinEluteVirus Spin Kit從50μl血清中抽提 WHV DNA。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定血清中WHV DNA拷貝數(shù)，引物為WHVSF1\WHVSR1(5’-GGCAACAACATAAAAGTCAC-3’\5’-AACTAAACCACGTGGTATGTC-3’)，梯度稀釋的WHV DNA質(zhì)粒做標(biāo)準(zhǔn)品。

5. 肝功能檢測(cè)

取血樣檢測(cè)感染后土撥鼠肝功能酶：丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)。

6. 病理診斷

甲醛固定的土撥鼠肝臟組織經(jīng)石蠟包埋，常規(guī)病理組織切片處理后，HE染色，顯微鏡下觀察病理改變。

7. 免疫組化

肝臟病變組織經(jīng)過(guò)組織修塊，石蠟包埋后，切片厚度為4μm，經(jīng)脫蠟水化，抗原修復(fù)，滴加20%正常山羊抗血清室溫封閉后，滴加兔抗WHsAg抗體，稀釋比例1:500,4度過(guò)夜。次日PBS洗滌，滴加熒光標(biāo)記二抗，稀釋比例1:5 000，PBS洗滌后，DAB顯色，脫水封片，鏡下觀察。

人乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitisB virus, HBV）感染引起的傳染病，至少有20億人曾經(jīng)被乙肝病毒感染。HBV是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科，據(jù)目前所知，HBV只對(duì)人和猩猩有易感性。HBV在肝內(nèi)繁殖復(fù)制，但是對(duì)肝細(xì)胞無(wú)明顯的直接損傷作用，但會(huì)引發(fā)免疫系統(tǒng)攻擊感染HBV的肝細(xì)胞，形成慢性肝炎，繼而發(fā)展為肝纖維化，是引發(fā)肝癌的重要因素。

目前，由于HBV疫苗的使用，使HBV感染率顯著降低，但慢性乙肝存在較大的轉(zhuǎn)為肝癌的風(fēng)險(xiǎn)。由于缺乏理想的乙肝動(dòng)物模型，限制了針對(duì)乙肝病程發(fā)展和干預(yù)治療策略的研究進(jìn)展。

1978年，薩默斯(Summers)等發(fā)現(xiàn)費(fèi)城動(dòng)物園的土撥鼠感染土撥鼠肝炎病毒（Woodchuck HepatitisVirus，WHV）。WHV與HBV在形態(tài)學(xué)、基因結(jié)構(gòu)、基因產(chǎn)物、復(fù)制過(guò)程、流行病學(xué)及疾病和肝癌的發(fā)展上有很高的相似性，WHV可引起急性自限性感染和慢性感染，其發(fā)病機(jī)理及免疫反應(yīng)機(jī)制和HBV類(lèi)似。WHV感染成年土撥鼠會(huì)導(dǎo)致急性自限性肝炎，而感染新生土撥鼠會(huì)發(fā)展為慢性肝炎，慢性肝炎易發(fā)展為肝細(xì)胞癌（HCC），土撥鼠模型的疾病發(fā)展特征使其成為研究慢性乙型肝炎向終末期肝病轉(zhuǎn)化的理想動(dòng)物模型。